ibidi為腫瘤相關研究提供解決方案！
德國易必迪ibidi公司成立于2001年，位于馬丁雷德，鄰近慕尼黑。公司自成立以來，專注于細胞培養及功能實驗的耗材及儀器開發（見圖1），致力于為科研工作者提供操作簡單、能夠快速獲得實驗結果的高品質產品，在美國及歐美生物醫學領域收到歡迎，在國內，ibidi產品設計及其優良的產品性能也使其逐漸獲得相關科研工作者的關注與信賴。
圖1. ibidi部分產品展示
利用易必迪公司ibidi提供的系列產品，可以從細胞和分子水平上對腫瘤的發生、發展、侵襲與轉移等過程進行研究。下面以研究P蛋白在結腸癌發生發展中的作用為例，探討ibidi公司系列產品從免疫熒光檢測，到功能實驗測定細胞增殖、分化、凋亡、遷移及血管生成等與腫瘤發生發展密切相關的生物學行為中的應用。
P蛋白在結腸癌病人中高表達，并且與腫瘤大小及淋巴結轉移正相關。對于可能在腫瘤發生發展中起作用的特定蛋白分子，通過免疫熒光技術檢測其細胞內表達及定位，通常是研究的第一步。P蛋白是一個功能未知的新蛋白，我們首先制備了分別針對N端、C端及多個功能域的抗體，通過Western blotting和免疫熒光實驗來確定其表達及在細胞內的具體定位（圖2）。由于ibidi的m-slide所需細胞數、抗體量等都非常少，同時可以很方便地在同一片slide上進行細胞培養、固定、染色等操作（見圖2A），我們同批次在多個結腸癌細胞系中，利用自己制備的5個針對不同區域的抗體檢測了P蛋白的細胞內表達及定位，發現P蛋白在結腸癌細胞系中普遍高表達，主要定位在細胞質中，在細胞核周圍有聚集，核內也有少量信號（見圖2B）。
圖2. 蛋白P的細胞內定位。 A）實驗流程示意圖。將結腸癌細胞系Caco2按9000個細胞/孔的密度種植在ibidi的m-slide中，培養兩天后，在m-slide中直接固定細胞，孵育一抗（抗P蛋白）和熒光二抗，封片后在共聚焦顯微鏡下觀察。B）利用針對P蛋白不同區域的多種抗體進行免疫熒光實驗，均提示內源P蛋白特異性地定位在細胞質。右邊的免疫熒光圖紅色熒光顯示的是P蛋白的細胞內定位，綠色熒光（Na-K-ATPase）顯示的是細胞膜，藍色熒光（DAPI）顯示的是細胞核。
為了進一步了解P蛋白在腫瘤發生發展中可能的作用，我們一方面通過MTT實驗檢測抑制P蛋白對結腸癌細胞增殖的影響。結果發現，利用siRNA 降低P蛋白的表達顯著抑制Caco2細胞的增殖，而且這種抑制作用可以被外源表達的RNAi resistant 的P蛋白所挽救（rescue）。另一方面利用經典的傷口愈合實驗（也稱劃痕實驗）我們檢測了P蛋白的表達水平是否對細胞遷移有影響（圖3）。我們選用ibidi culture-insert產品代替傳統的槍頭劃痕方法，主要是基于ibidi生物相容性硅膠制成的插件，可產生確定的500μm “劃痕”區域，“劃痕”區域規整，配合配套的軟件分析方便獲得可靠的統計結果，實驗操作簡單，而且增強了實驗的重復性（圖3A）。我們選擇了在17小時之內的多個時間點觀察細胞的遷移情況。發現P蛋白的缺失對細胞遷移有明顯抑制作用（圖3B-C）。
圖3. P蛋白的缺失抑制了Caco2細胞的遷移。A）愈傷實驗流程示意圖。易必迪公司設計提供的愈傷實驗體系，有標準化的實驗流程和細胞培養器材：將5X104細胞種植在被culture-insert（Ibidi）分開的小室中，等細胞貼壁長滿后，去除culture-insert，讓細胞自由爬過中間的“cell free gap”（約500mm），在不同時間點鏡下觀察愈傷過程。B）顯微鏡下觀察發現，RNAi P蛋白明顯抑制細胞的遷移，細胞層的愈傷過程受到嚴重影響。C）B圖的定量分析顯示，17小時后，對照組細胞層已經愈合超過90%，而P蛋白RNAi的細胞覆蓋的傷口面積僅為對照組細胞的30%。
腫瘤細胞向局部侵犯或遠處轉移是惡性腫瘤重要的特性之一。我們利用ibidi可視化的“transwell”--ibipore 產品（見圖4A）檢測了P蛋白對結腸癌細胞侵襲的影響。ibipore產品有上下兩個獨立的通道（見圖4B），兩個通道overlap的區域由一個孔徑大小均一的玻璃網篩隔離開（見圖4C）。兩個通道可以分別培養細胞，通過兩種方式，細胞可以貼壁于玻璃網篩的上下兩側。在細胞侵襲實驗中（見圖4D），ibipore考慮到這一因素，采用兩側可以培養細胞的玻璃網篩的設計，可以檢測細胞向上側通道進行遷移的能力，進而巧妙的排除了重力作用對侵襲實驗的影響，而且光學成像特性好，可以實時觀察細胞的侵襲情況。配合ibidi流體剪切力系統以及加熱孵育系統，可以在流動、剪切力條件下實時的觀察細胞的侵襲以及遷移等實驗。我們采用ibipore產品實時觀察腫瘤細胞向上側小室侵襲的情況，發現P蛋白Knockdown的細胞向上側侵襲的能力顯著低于野生型細胞（數據未展示）。
圖4.可視化的細胞侵襲產品—ibipore。A）ibipore及ibipore玻璃膜培養細胞的染色結果。圖片背景為在ibipore玻璃膜上培養細胞的熒光染色結果，規則排布的白色圓點為玻璃膜的孔隙。B）ibipore組成示意圖，上下兩個獨立的細胞培養通道，中間overlap區域由孔徑大小均一的玻璃網篩隔離開。C）3μm孔徑玻璃網篩。D）細胞侵襲應用舉例。
為了進一步驗證P蛋白在腸癌的惡性轉化過程中的作用，我們構建了P蛋白被穩定敲除的HCT-116細胞。裸鼠成瘤實驗結果證明，P蛋白表達被抑制后，HCT-116的裸鼠成瘤能力受到非常顯著的抑制。
上述實驗結果提示P蛋白的表達與結腸癌的發生發展有著密切的相關性。為了尋找其分子機理，我們通過microarray的方法檢測P蛋白knockdown引起基因表達譜的變化，從而尋找P蛋白可能參與調控的下游基因。非常有意思的是，我們發現P蛋白影響了一系列與增殖、趨化及血管生成相關的基因。我們選擇了改變顯著，同時與腫瘤轉移密切相關的CXCR4和VEGF-A兩個分子進一步驗證。發現在結腸癌細胞中抑制P蛋白的表達，會明顯降低這兩個分子在mRNA及蛋白水平的表達。
CXCR4是趨化因子基質細胞衍生因子-1（CXCL12）的特異受體，有報道稱其與結腸癌的轉移相關。由于P蛋白在結腸癌病人中與腫瘤淋巴結轉移正相關，我們推測P蛋白可能通過調節CXCR4的表達而影響結腸癌的轉移，因而通過趨化實驗比較了P蛋白被敲除的CaCo2細胞及相應對照組細胞在CXCL12刺激下的遷移情況（圖5）。我們利用ibidi chemotaxis3D進行了細胞趨化實驗檢測。ibidi chemotaxis3D可以進行2D或者3D的細胞趨化實驗（將細胞種入圖5A“1”區域），在“2”“3”小室直接加入含有趨化因子的培養液，或者直接種入細胞，以研究細胞分泌物對“1”區域細胞的影響。1張板上3個chambers的設計方便同時進行并行的對照實驗，一次獲得實驗所需的所有結果（圖5B）。配合ibidi的活細胞加熱孵育系統監測（圖5C），可以進行長時間穩定的細胞培養基成像。ibidi加熱孵育系統獨特的頂蓋玻璃蓋加熱設計，使溫度高于平板，在頂蓋和培養板之間形成垂直溫度梯度，有效避免培養液蒸發而影響細胞培養條件，以及培養皿蓋冷凝而影響顯微成像質量等問題。實驗結果發現，對照組Caco2細胞向含有CXCL12的小室方向遷移（圖5D），而P蛋白敲除的CaCo2細胞則向兩邊隨機遷移（圖5E）。
圖5. P蛋白的缺失抑制了Caco2細胞向CXCL12刺激方向遷移。A）趨化實驗設計示意圖。CaCo2細胞種植在ibidi μ-Slide Chemotaxis3D中間的“1”區域。B）實驗組的“2”中加含有CXCL12的培液，“3”中加普通培液；對照組的“2”和“3”中加同樣的培液，之后用ibidi的活細胞孵育系統連續觀察細胞的遷移情況。 B）Ibidi活體孵育系統示意圖。C）ibidi的溫控系統和CO2補充系統保證了細胞的培養條件可以長時期保持穩定，孵育小室加熱的頂蓋則保證了鏡下觀察時不受冷凝水的干擾，成像質量優異。D）對照組Caco2細胞向含有CXCL12的小室方向遷移，而P蛋白敲除的CaCo2細胞則向兩邊隨機遷移。E）細胞趨化運動結果定量分析。利用WimTaxis Image Analysis軟件進行細胞運動軌跡追蹤、分析。
P蛋白影響的另一個分子VEGF-A與血管生成密切相關，而血管新生在腫瘤的生長和轉移過程中都起著至關重要的作用。P蛋白促進成瘤，那么P蛋白是否會通過促進結腸癌細胞分泌VEGF-A，而促進腫瘤的血管新生呢？我們采用ibidi研究血管生成的產品進行實驗。ibidiμ-Slide Angiogenesis具有獨特的雙層孔洞設計，在圖6A圖中“黃色”孔洞加入Matrix gel,形成厚度均勻的膠平面，上層孔洞用來加入細胞培養液（粉色區域），所需細胞和試劑用量少。與傳統方法相比較（圖6B），ibidi產品可以輕松形成平整的膠平面，能夠將細胞均勻的鋪在Matrix gel上，方便觀察統計血管新生形成的分支點、成環數量以及細胞占據的面積等參數。而傳統方法往往形成凹形的膠平面，膠表面不平整，細胞分布不均勻，使得細胞成像及統計變得困難。而且ibidi配套開發的統計軟件可以解放勞動力，只要將間隔采取的圖像上傳，就可以輕松獲得統計結果（圖6C）。我們檢測了野生型CaCo2細胞及P蛋白敲除的CaCo2細胞的conditional media對HUVEC細胞血管生成的影響，結果發現發現野生型CaCo2細胞的conditional media相比P蛋白敲除的CaCo2的conditional media對HUVEC細胞tube formation有明顯的促進作用（圖6D）。
圖6. Caco2細胞的conditional media對HUVEC細胞血管生成的影響。A）tube formation實驗設計示意圖。B）ibidi血管生成產品優勢：與普通96孔板相比，ibidi 的“μ-Slide Angiogenesis”所需細胞和試劑量很少，且能讓所有細胞處于同一光學平面，提高成像質量。C）利用ibidi血管生成產品實驗步驟簡單，配合軟件分析，輕松獲得血管新生的統計結果。D）HUVEC細胞種植在ibidi 的μ-Slide Angiogenesis中，加入野生型CaCo2細胞或P蛋白敲除的CaCo2細胞的conditional media，觀察細胞tube formation情況。利用ibidi的活細胞孵育系統連續觀察拍攝HUVEC細胞的tube formation情況，可以看到野生型CaCo2細胞的conditional media孵育的HUVEC細胞（upper pannel），相比P蛋白敲除的CaCo2的conditional media孵育的細胞（lower pannel），其小管形成明顯增多、密度更高。
綜述所述，我們利用易必迪ibidi公司提供的系列產品，借助其優異的光學性能，標準化的實驗設計，對P蛋白在結腸癌發生發展過程中的作用及其機理進行了系統研究，發現P蛋白在結腸癌細胞的增殖、遷移、成瘤等過程中起重要作用，并進一步尋找了其下游的作用分子，驗證了P蛋白通過CXCR4和VEGF-A在細胞定向趨化和血管生成中的關鍵作用。
ICP備案號：
滬ICP備15057650號-1
滬公網安備31011202005471
雷萌生物科技(上海)有限公司 保留所有版權.
